Luca Ghini istituisce l'Orto nel 1544, quando Cosimo I lo chiama alla cattedra di botanica dell'Università di Pisa. Nel 1591 l'Orto viene spostato nella sede attuale e nel 1752 è trasformata la facciata della galleria. Nell'Orto sono presenti alberi secolari: la Magnolia grandiflora e un Ginkgo biloba piantati nel 1787, un Platanus occidentalis del 1808, un mirto del 1815, infine un albero di canfora (Cinnamomum camphora) introdotto attorno al 1842. Di straordinaria importanza sono le collezioni naturalistiche e gli erbari di piante secche (Herbarium Horti Pisani).